206251 Molekulare Zellbiologie B (S+Pr) (SoSe 2014)

Proteine gehören zu den wichtigsten Biomolekülen und sie erfüllen in jedem Organismus die unterschiedlichsten Aufgaben. Sie sind unentbehrlich beim Aufbau von Zellen und Organellen; auch die Speicherung, die Verarbeitung und der Transport von Stoffen aller Art würden ohne Proteine nicht möglich sein. Manche Proteine sind bei der Signaltransduktion maßgeblich an der Übermittlung von Informationen beteiligt, andere Proteine bilden Stützstrukturen, andere Proteine sind für Bewegungsvorgänge essentiell, wieder andere helfen bei der Abwehr von Krankheitserregern. Eine wichtige Untergruppe der Proteine, die Enzyme, ist für die Katalyse tausender biochemischer Reaktionen in der Zelle verantwortlich. Darüber hinaus werden die allermeisten zellulären Funktionen mit Hilfe von Proteinen gesteuert.
Die Charakterisierung und die Aufklärung der Funktion von Proteinen ist eine Grundvoraussetzung um biologische Vorgänge auf zellulärer und molekularer Ebene verstehen zu können. Im Rahmen der funktionellen Charakterisierung von Proteinen ist die Bestimmung ihrer subzellulären Lokalisation von entscheidender Bedeutung.

Im Rahmen dieses Moduls werden die für die zelluläre Lokalisation eines Proteins erforderlichen Schritte von den Studierenden selbst experimentell durchgeführt. Dazu gehört die Amplifizierung von Zielgenen, die Klonierung von Genen bzw. von Genfragmenten unter Verwendung geeigneter Vektoren, und die Herstellung von Fusionsgenkonstrukten bestehend aus Zielgen und dem Gen des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP). Mit Hilfe der Fusionsgenkonstrukte werden transgene Pflanzen, hier Erbsen, erzeugt, wobei der Gentransfer mittels Particle Gun erfolgt (Biolistische Transformation). Die transformierten Zellen der Erbse werden anschließend am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) untersucht. Durch die GFP-Fluoreszenz können die Fusionsproteine in der Zelle lokalisiert werden.

Arbeitsschritte:
1. Isolierung von DNA und RNA aus Pisum sativum (Erbse)
2. Amplifizierung und anschließende Klonierung verschiedener Zielgene
3. Herstellung von Fusionskonstrukten aus den klonierten Zielgenen und dem Gen des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP)
4. Biolistische Transformation von Erbsenblatt-Epithelzellen mittels Particle Gun
5. Untersuchung der subzellulären Lokalisation der Fusionsproteine mittels GFP Fluoreszenzmessung am konfokalen Laser Scanning Mikroskop